RIPA Buffer (10X)

1. 如果繼續(xù)使用緩沖液，則建議將 10X 緩沖液保存在 4°C 下 1-2 周。如要保存更長時(shí)間，則緩沖液應(yīng)保存在 -20°C 下。如果要進(jìn)行數(shù)次實(shí)驗(yàn)，則建議分裝 10X 緩沖液。

2. 在 24-30°C 下解凍 10x 緩沖液，上下顛倒混合。

3. 用 ddH2O 將 10X RIPA Buffer 稀釋為 1X 溶液。該產(chǎn)品提供的 10X 材料足以制備 150ml 總細(xì)胞提取物。

4. 將 1X 緩沖液放在冰上冷凍，并在使用前立即添加 PMSF。

注意：CST 建議使用前立即添加 1 mM PMSF。

裂解：

如需裂解黏附細(xì)胞，我們建議以下步驟：（所有試劑和裂解物必須冷藏）。

1. 按需處理細(xì)胞。

2. 平板用 PBS 洗滌，以去除殘留的培養(yǎng)基。

3. 每個(gè) 10 cm 的培養(yǎng)皿添加 400 μl 1x RIPA 緩沖液。

4. 平板放在冰上孵育 5 分鐘。

5. 刮取細(xì)胞。

6. 超聲短暫處理。

7. 提取物用冷微量離心機(jī)以 14,000 x g 的離心力離心分離 10 分鐘。

8. 取上清液后使用。

其他注意事項(xiàng)：

1. 對于非黏附細(xì)胞，用 1X PBS 洗滌并進(jìn)行沉淀后，每 10⁷ 個(gè)細(xì)胞添加 400 μl 緩沖液。

2. 1X RIPA Buffer 可用于裂解組織樣品，盡管在添加裂解緩沖液后建議進(jìn)入均化步驟。按照 100 mg 組織對應(yīng) 1 ml 緩沖液的比例提取組織。組織提取物還需進(jìn)行超聲處理。

3. 其他蛋白酶抑制劑可添加到 1x 裂解緩沖液中。

4. 試劑抵達(dá)時(shí)，該緩沖液中可能會(huì)發(fā)生聚沉，因?yàn)樘峁┑?10X 配制液中包含高濃度的試劑。有時(shí)，即便加熱到室溫，也會(huì)持續(xù)聚沉。我們建議將緩沖液加熱到 37°C 15 分鐘后混合，以消除沉淀?；蛴?ddH2O 將 10X RIPA 稀釋為至少 5X 的溶液，以便獲得不含沉淀物的溶液。一旦稀釋，可進(jìn)行分裝并保存在 -20°C 下供日后使用。